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                冰冻切片参考实验步骤
                作者:江苏镇江厚普生物科技有限公司  来源:  发表时间:[2011-10-29]  点击:3355

                切片制备:将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内(直径2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有∮液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮内,大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80冰箱储存备用,或置于恒冷切片机冰冻切片。冰冻切片4~8mm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

                1. 冰冻切片室温放置30分钟后,入4丙酮固定10分钟,也可根据需△要选择其他方式。PBS洗,5min3次;

                2. 3% H2O2去离子水37孵育10minPBS洗,5min2次;

                3. 510%正常山羊血清封闭,37孵育10-20min,倾去血清,勿洗

                4. 适当比例的●一抗工作液孵育,4过夜或37 12h

                5. 复温20minPBS3min,三次;

                6. 二抗孵育:加生物素化标记二抗,3710-15minPBS3min,三次;

                7. 三抗孵育:加辣根酶标记的链酶卵白素,3710-15minPBS3min,三次;

                8. DAB显色剂显色(或AEC显色),镜下观察结果,适时终止;

                9. 苏木素复染5min,自来水冲洗片刻,75%的盐酸酒精溶液分化30s,自来水冲洗5min蓝化;

                10. 脱水。依次经过70%80%90%95%、无水乙醇,各2min,二甲苯15min,三次;

                11. 封片,中性树胶封◢片。

                光学显微镜100×或400×观察,拍片。

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